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用DNase I解决细胞悬液产生团块的问题

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发表于 2013-10-16 14:33:34 | 显示全部楼层 |阅读模式
在细胞分选中,制备单细胞悬液的步骤对于细胞分选的成功与否尤为重要。在分选的样本中,细胞团块的形成会影响对靶细胞的标记,且会导致细胞回收率降低。
通常,当样本被反复冻融或在酶的消化解离作用下会生成“细胞团块”。这是由于实验环境压力使样本中的细胞死亡率升高, 导致死亡细胞释放“粘性的”DNA分子,这种分子会将周围的细胞黏连在一起结成团块。

向样本中加入脱氧核糖核酸酶I(DNase I)能够降低这些自由漂移的DNA片段及其形成的细胞团的作用块。目前有很多应用DNase I处理样本来减少细胞成团的实验方法和步骤。我们推荐向细胞悬液中加入DNase I Solution (Catalog # 07900),使最终浓度达到0.1 mg/mL (或200 Kunitz units/mL),室温下孵育15分钟,然后继续进行下游实验。

以下解冻样本的实验步骤介绍了怎样制备单细胞悬液以及如何使用DNase I 减少细胞团块的形成。
1. 将冻存细胞小管在37 °C水浴箱内转动使之快速解冻。将解冻的细胞转移至无菌的50 mL离心管中。可选:可在转移解冻细胞前向离心管中直接加入0.25 至0.5 mL 的1 mg/mL DNase I溶液。
2. 用1mL含有10% FBS的细胞培养基或缓冲液(如PBS或HBSS)冲洗冻存细胞管并将冲洗细胞管之后的液体转移至新试管中,以确保回收所有细胞。
3. 向离心管中缓慢滴入10-15 mL含有10% FBS的细胞培养基或缓冲液,同时缓慢转动试管。
4. 向50 mL离心管中加满含有10% FBS的细胞培养基或缓冲液,轻轻上下翻转试管使细胞与液体混悬。
5. 将50 mL离心管室温下离心以收集细胞, 300 x g ,离心10 分钟(离心机转速可应用以下G to RPM conversion计算小工具进行计算)。
6. 离心后小心地将上清液移除,移除上清液时注意不要触碰到离心所得的细胞团,然后轻轻弹击试管重悬细胞团。
7. 如果细胞出现细胞团块,计算应加入样品的DNase I量使其最终浓度达到 0.1 mg/mL。向试管中缓慢滴入DNase I,同时缓慢转动试管。室温下孵育15分钟。
向离心管中缓慢滴入25 mL含有2% FBS的细胞培养基或缓冲液,同时缓慢转动试管然后离心,离心转速及时间同上。离心后尽可能地将上清液全部移除,然后轻轻重悬细胞。
8. 如果细胞仍然出现细胞团块,可将样本用30 - 70 微米的滤网滤到一个新的离心管中,用含有2% FBS的细胞培养基或缓冲液冲洗装样本的试管三次并将冲洗液用滤网过滤至新的离心管中。
9. 细胞悬液现在已准备好可以用于细胞计数或细胞分选等的下游应用。

注意:如果下游应用对DNase敏感(如造血细胞集落实验),可在进行下游实验前用相应的实验缓冲液(不含DNase)洗细胞一次。
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